Editiranje gena bez korištenja virusa

Uređivanje gena moćna je metoda za istraživanje i terapiju. Od pojave Nobelovom nagradom nagrađene tehnologije CRISPR/Cas9, brzog i preciznog alata za uređivanje genoma otkrivenog 2012., znanstvenici rade na istraživanju njegovih mogućnosti i poboljšanju performansi.

Istraživači u laboratoriju biologa Chrisa Richardsona sa sveučilišta UC Santa Barbara spojili su taj alat s metodom koja povećava učinkovitost uređivanja CRISPR/Cas9 bez upotrebe virusnog materijala za isporuku genetskog predloška koji se koristi za uređivanje ciljne genetske sekvence.

Prema njihovom novom radu objavljenom u časopisu Nature Biotechnology, nova metoda stimulira popravak usmjeren na homologiju (korak u procesu uređivanja gena) približno tri puta "bez povećanja učestalosti mutacija ili mijenjanja ishoda popravka spajanja krajeva".

"Pronašli smo kemijsku modifikaciju koja poboljšava nevirusno uređivanje gena i također otkrili intrigantnu novu vrstu popravka DNK", rekao je Richardson.

Metoda CRISPR/Cas9 funkcionira tako da koristi obrambenu tehniku ​​koju koriste bakterije protiv virusnih napadača. Da bi to učinile, bakterije odrežu dio genetskog materijala napadačkog virusa i ugrade ga u svoj kako bi ga kasnije prepoznale. Ako se bakterije ponovno zaraze, mogu ciljati sada poznate genetske sekvence za uništenje.

U uređivanju gena, ovaj proces koristi enzim Cas9 kao molekularne "škare" za rezanje sekvenci koje prepoznaje, vođen CRISPR sustavom. Ovaj rez također je prilika za zamjenu odsječenih gena sličnim (homolognim), ali poboljšanim, korištenjem staničnih prirodnih mehanizama popravka. Ako bude uspješna, stanica bi nakon toga trebala imati modificirane funkcije.

Često se koriste virusi za isporuku DNK predloška za popravak u jezgru stanice u kojoj živi njezin genetski materijal. Virusni tijek rada "skup je, težak za skaliranje i potencijalno otrovan za stanice", navode istraživači.

Nevirusni predlošci potencijalno su jeftiniji i skalabilniji, iako istraživači još uvijek moraju prevladati prepreke učinkovitosti i toksičnosti. U svojoj studiji Richardson Lab otkrio je da uvođenje međulančanih poprečnih veza u tijek rada dramatično povećava popravak usmjeren na homologiju.

"Svaki tijek rada u koji smo stavili ovaj pristup funkcionirao je otprilike trostruko bolje", rekao je Richardson.

Međulančne veze su lezije koje drže dvostruke niti spirale DNK vezane jedna za drugu, što ih čini nesposobnima za replikaciju. Kemoterapije raka koriste ovaj mehanizam za prekid rasta tumora i ubijanje stanica raka. Međutim, kada su dodane šabloni za popravak usmjerene prema homologiji, ove poprečne veze stimuliraju prirodne mehanizme popravka stanice i povećavaju vjerojatnost uspjeha uređivanja. 

"U osnovi, ono što smo učinili je da smo uzeli ovaj predložak DNK i oštetili ga", rekao je Richardson. "Zapravo smo ga oštetili na najteži način koji mi pada na pamet. A rezultat je visoko učinkovit i minimalno sklon pogreškama nevirusni sustav za uređivanje gena".

Njihovo otkriće, poput mnogih otkrića u znanosti, zapravo je bila sretna nesreća. Dok je radila na pročišćavanju proteina za proučavanje popravka DNK, diplomirana studentica istraživačica i glavna autorica Hannah Ghasemi primijetila je neočekivane promjene u ishodima njihovih eksperimenata.

"Uvodili smo te kemijske modifikacije u predloške DNK kako bismo ih mogli izvući iz stanica i vidjeti koji su proteini vezani za njih, a ja sam samo provjeravala je li ta modifikacija na bilo koji način utjecala na uređivanje ," rekla je. "Očekivala sam ili da neću vidjeti nikakvu promjenu ili da je to zapravo moglo negativno utjecati na uređivanje."

Ono što je umjesto toga otkrila bio je pozitivan učinak, do tri puta veći od aktivnosti uređivanja u odnosu na neumrežene kontrole. Nadalje, tim je otkrio da čak i uz povećanje uređivanja - a time i šanse za pogreške - nije došlo do povećanja učestalosti mutacija.

"Ono što mislimo da se događa jest da stanica detektira i pokušava popraviti oštećenu DNK kojoj smo dodali ovu poprečnu vezu", rekao je Richardson. "Čineći to, odgađa stanicu da prođe kontrolnu točku gdje bi inače zaustavila ovaj proces rekombinacije. I tako produljenjem vremena koje je stanici potrebno za ovu rekombinaciju, povećava se vjerojatnost da će uređivanja ići do kraja." Proučavanje ovog novog procesa također bi moglo dovesti do boljeg razumijevanja o tome kako stanice otkrivaju reagense za uređivanje i kako "odlučuju" hoće li ih prihvatiti ili ne, rekao je.

Ova metoda će se prema timu najviše koristiti u ex-vivo aplikacijama za uređivanje gena, odnosno u području istraživanja bolesti i pretkliničkog rada.